Metoda Grama jest barwieniem różnicującym, które pozwala wstępnie podzielić bakterie na Gram-dodatnie i Gram-ujemne. Kluczowe jest wykonanie etapów w odpowiedniej kolejności, ponieważ każdy z nich przygotowuje materiał do następnego kroku.
Najpierw stosuje się fiolet krystaliczny – barwnik podstawowy, który barwi komórki na fioletowo. Następnie podaje się jod (zaprawę), który tworzy z fioletem kompleks trudniej wypłukiwany ze ściany komórkowej. Potem następuje odbarwianie alkoholem (czasem alkoholem z acetonem) – to etap krytyczny: u bakterii Gram-ujemnych kompleks barwnika jest usuwany skuteczniej, a u Gram-dodatnich pozostaje związany m.in. dzięki grubszej warstwie peptydoglikanu.
Po odbarwieniu wykonuje się barwienie kontrastowe safraniną, aby komórki, które utraciły fiolet, stały się widoczne (zwykle na czerwono/różowo). W praktyce laboratoryjnej płukanie wodą jest zwykle wykonywane pomiędzy kolejnymi odczynnikami, aby usunąć ich nadmiar i zatrzymać reakcję na danym etapie.
Dlaczego pozostałe propozycje kolejności są błędne?
- Wariant z płukaniem wodą przed jodem rozdziela etap barwienia podstawowego i zaprawy w sposób niezgodny z logiką metody; zaprawa powinna działać na zabarwiony preparat, utrwalając kompleks barwnika.
- Wariant rozpoczynający od safraniny i kończący fioletem odwraca sens barwienia różnicującego: kontrast stosuje się dopiero po odbarwieniu, aby uwidocznić komórki, które straciły barwnik podstawowy.
- Wariant zaczynający od jodu jest niepoprawny, bo zaprawa nie spełni swojej funkcji bez wcześniejszego zabarwienia fioletem krystalicznym.
Wskazówka egzaminacyjna: zapamiętaj schemat "barwnik – zaprawa – odbarwianie – kontrast". To pomaga odtworzyć kolejność nawet wtedy, gdy w odpowiedziach różni się liczba płukań.
